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Titolo della tecnologia:

Sviluppo di Kit per l’identificazione di mutazioni alfa e delta talassemiche

# Scheda: 
91
Italian
Data Sottomissione: 
02/2014
Descrizione della tecnologia 

Presso L’IGB sono stati svolti progetti di epidemiologia molecolare per identificare la base molecolare dell’alfa talassemia e della delta talassemia nell’Italia meridionale.

L’alfa talassemia rappresenta uno dei più diffusi disordini ereditari. A causa della presenza di geni duplicati si osservano fenotipi molti differenti tra loro per l’inattivazione di un numero variabile di geni che va da 1 a 4. La diagnosi ematologica è resa difficile dall’assenza di marcatori specifici; la diagnosi molecolare è resa difficile dalle caratterictiche del cluster (alto contenuto in GC e alta omologia) che richiedono condizioni di analisi adeguate ed estreme. La base molecolare si è mostrata molto eterogenea. 44 alleli alfa talassemici sono stati identificati di cui 18 di tipo delezionale e 28 di tipo puntiforme.

La presenza di delta talassemia può causare la mancata diagnosi di beta talassemia che in omozigosi causa trasfusione dipendenza. 26 alleli delta talassemici sono stati identificati presso l’IGB; tra essi la Hb A2-Yalousa ha una frequenza del 70% seguita dalla Hb A2-Mitsero e Hb A2-NYU. Molte delle mutazioni identificate sono state descritte in altre regioni del mediterraneo.

Il laboratorio proponenete ha messo a punto un serie di protocolli molecolari per l’identificazione diretta di mutazioni puntiformi e mutazioni delezionali dei geni alfa e delta globinici.

Il protocollo per l’identificazione delle mutazioni puntiformi si bassa sul disegno di oligonucleotidi ARMS (amplification refractory mutation system) che sono in grado di amplificare in maniera selettiva solo l’allele, normale o mutato, per cui sono stati disegnati. Sono stati messi a punto sia protocolli per lo screening di una sola mutazione e sia protocolli multiplex per lo screening contemporaneo di più mutazioni. Nel caso di amplificazioni multiplex i frammenti generati avranno lunghezze diverse e specifiche per ogni mutazione in esame.

Per l’identificazione delle mutazioni delezionali sono stati messi a punto protocolli di gap-PCR, basati sull’uso di oligonucleotidi posizionati all’esterno delle regione deleta. Grazie alla distanza che in soggetti normali separa gli oligonucleotidi, solo in caso di positività per la delezione si otterrà uno specifico prodotto di PCR.

Entrambe le metodiche richiedono: l’utilizzo di un controllo interno di amplificazione, utile nel caso il campione risulti negativo per la mutazione testata; la separazione dei frammenti amplificati mediante elettroforesi su gel.

Per una analisi più rapida e automatizzata, gli oligo (ARMS, per la gap-PCR e per il controllo interno di PCR) possono essere forniti di fluorocromi al 5’ e l’amplificazione effettuata utilizzando macchine per real time-PCR. In caso di positività vi sarà emissione di fluorescenza del colore specifico a cui è stata associata la mutazione o delezione oltre a quella generata dal controlo interno. In questo modo l’analisi di genotipo avverrà direttamente sui campioni amplificati senza aver necessità di separare i frammenti. Se di interesse, questo tipo di applicazione va sviluppata.

Anche altre metodologie di analisi possono essere messe a punto poiché il gruppo proponente ha a disposizione una genoteca di campioni tipizzati.

Caratteristiche e Vantaggi 

Non esistono in commercio kit per la diagnosi molecolare di delta talassemia. In caso di sospetto è necessario effettuare il sequenziamento di tutto il gene delta globinico o utilizzare protocolli sviluppati nei laboratori.

Nel caso delle alfa talassemie esistono in commercio tre kit che permettono l’identificazione di un numero limitato di mutazioni. Un kit è disegnato per lo screening delle sole mutazioni delezionali e prevede due passaggi: amplificazione e separazione su gel. Anche gli altri due kit prevedono più passaggi: in un caso amplificazione, reverse-ibridazione e sviluppo del colore, nell’altro caso amplificazione, digestione con enzimi di restrizione e separazione su gel.

Le caratteristiche innovative sono:

  • per le delta talassemie - immettere per la prima volta sul mercato un kit per la diagnosi molecolare;
  • per le alfa talassemie - ampliare il numero di mutazioni identificabile e già riscontrate nel bacino del mediterraneo.
  • Utilizzo di oligo ARMS per l’identificazione diretta delle mutazioni puntiformi.

Il vantaggio competitivo è rappresentato dal fatto che la diagnosi può essere effettuata in tempi più rapidi poiché prevede solo due step, amplificazione e separazione elettroforetica.

Nel caso di implementazione del protocollo con oligo con fluorocromi, i tempi si ridurrebbero ulteriormente poiché la diagnosi potrà essere effettuata subito dopo la reazione di PCR.

Stadio di sviluppo della tecnologia/prodotto 
TRL: 
6
Tecnologia brevettabile 
Si
Proprietà Intellettuale
Tecnologia Brevettata: 
No
Pubblicità della tecnologia
Pubblicata: 
Si
Licensing out: 
No
Validazione tecnologica/Dimostrazione
Validazione Interna: 
Si
Validazione esterna: 
No
Validazioni Caratteristiche funzionali
Esistenza di un prototipo: 
Si
Informazioni significative
Posizionamento nel mercato 
Tecnologia trasferibile al mercato
Tecnologia trasferibile al mercato: 
Si

Analisi di fattibilità tecnico/economico/finanziaria