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Scheda del laboratorio:

Generazione di modelli murini geneticamente modificati per la ricerca biomedica di base e applicata

Area tematica: 
Funzionalita' del laboratorio: 

L’infrastruttura proposta è una piattaforma di supporto alla ricerca dedicata alla realizzazione e caratterizzazione di modelli animali geneticamente modificati (transgenici, knockout, knockin). La proposta si basa sull’esperienza e le strutture di un laboratorio impegnato da anni nella realizzazione di topi mutanti destinati allo studio dei meccanismi di base dei processi biologici fondamentali e delle loro alterazioni patologiche, con una ricaduta applicativa nell'identificazione di percorsi innovativi diagnostici e terapeutici. Le potenzialità dell’infrastruttura includono, oltre alle tecnologie standard di mutagenesi in vivo, anche l'applicazione delle tecnologie genetiche più avanzate per la generazione di modelli animali come Zinc Finger Nucleases (ZFN), Transcription activator-like effector nucleases (TALEN), Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat (CRISPS/Cas-based RNA-guided DNA endonucleases). Il laboratorio dispone di spazi dedicati, dotati di strumentazione completa per la microiniezione e per il prelievo, la manipolazione e il trasferimento in utero di embrioni murini pre-impianto.

Gli animali necessari all’attività dell’infrastruttura sono ospitati presso lo stabulario del Santa Lucia-CERC (Centro Europeo per la Ricerca sul Cervello) e le prestazioni offerte sono:

  • microiniezione di cDNA, RNA, anticorpi, oligonucleotidi o cellule staminali embrionali (ES) in embrioni murini.
  • Riderivazioni di linee murine per scopi sperimentali o di adeguamento allo stato sanitario dello stabulario ricevente.
  • Backcrossing di linee mutanti su diverso background genetico.
  • Criopresevazione di gameti o embrioni e fertilizzazione in vitro.
  • Microchirurgia, prelievi di organi e tessuti per analisi biochimiche, istologiche ed immunoistochimiche.
  • Trattamenti farmacologici e di terapia genica.
  • Realizzazione di attività didattiche, corsi di formazione e servizio di consulenza sulle tematiche citate.

 

Servizi offerti: 

I servizi offerti sono finalizzati alla generazione, genotipizzazione e caratterizzazione fenotipica dei modelli animali mutati richiesti dall’utenza. Gli utenti della piattaforma sono principalmente gli istituti dell’area biomedica del CNR, l’ISS, Università e IRCCS dell’area di Roma e, su piccola scala, altre Università italiane e straniere. Come risulta dal sito della International Society for Transgenic Tecnology, http://www.transtechsociety.org/linkstg.php, in Italia esistono pochissime strutture che producono modelli murini mutanti e prevalentemente per ricercatori interni se si tratta di strutture di ricerca o a pagamento nel caso di società “profit”. Esiste quindi un notevole spazio di “mercato” per i servizi offerti dalla piattaforma, a condizione di passare da un livello di attività “artigianale” ad un livello di produttività ed efficienza tali da far fronte alla domanda potenziale del mercato italiano che attualmente si rivolge per lo più ad aziende di biotecnologia pagando tariffe molto alte. La piattaforma se adeguata e potenziata può quindi diventare un servizio di riferimento a livello nazionale. A tal fine si possono prevedere l’adeguamento della strumentazione e del personale e una serie di iniziative mirate a “pubblicizzare” diffusamente presso tutti i potenziali “clienti” i servizi offerti, individuando anche un tariffario modulato in base alla tipologia di committente, per consentire in prospettiva un’autosufficienza economica della piattaforma stessa.
 

Piattaforme Tecnologiche: 

Descrizione: 
Microscopio invertito dotato di obbiettivi da 50x a 200x per la visione in campo chiaro e in contrasto di fase. Dotato di fotocamera Fotocamera Nikon Coolpix 8400 (2006) e schermo Funai LCD-A1504 (2006) per scopi didattici e di formazione.
Campo di applicazione: 
Microiniezione di cDNA, RNA, anticorpi, oligonucleotidi o cellule staminali embrionali (ES) in zigoti e blastocisti. Analisi di campioni Istologici. Didattica e formazione.
Descrizione: 
Sistema elettronico di comando a distanza del movimento dei capillari di microiniezione e di trattenimento/spostamento degli embrioni. Dotati di joystick, regolazione della velocità e dell’ampiezza degli spostamenti su tre assi e sistema di de-moltiplicazione del movimento per spostamenti micrometrici dei capillari.
Campo di applicazione: 
Manipolazione dei capillari per la microiniezione e il trattenimento/spostamento degli embrioni e nel il campo del microscopio.
Descrizione: 
Due microiniettori manuali dotati di pistone a vite con sistema di trasmissione dell’aspirazione/rilascio controllati da aria o da olio minerale.
Campo di applicazione: 
Controllo fine dell’dell’aspirazione/rilascio di embrioni e cellule ES durante il procedimento di microiniezione.
Descrizione: 
Compressore a pressione regolabile per iniettare soluzioni di DNA, RNA, proteine negli embrioni attraverso capillari di piccolo diametro. Funzione di impulso di pressione per pulizia capillari.
Campo di applicazione: 
Microiniezione di DNA, RNA, proteine nel pronucleo di zigoti
Descrizione: 
Stereomicroscopio con illuminazione sotto il piano di appoggio in vetro e ingrandimento progressivamente regolabile da 5x 80x.
Campo di applicazione: 
Prelievo di embrioni dagli ovidotti. Isolamento, selezione manipolazione degli embrioni prima della microiniezione.
Descrizione: 
Stereomicroscopio con illuminazione esterna veicolata da fibre ottiche ingrandimento progressivamente regolabile da 5x 60x. Con uscita per riprese fotografiche del campo ottico.
Campo di applicazione: 
Interventi di microchirurgia per l’impianto in utero di embrioni microiniettati.
Descrizione: 
Incubatore per embrioni con temperatura e tensione di CO2 regolabili
Campo di applicazione: 
Coltura di embrioni pre-impianto – Coltura di ES cells
Descrizione: 
Thermocycler per PCR
Campo di applicazione: 
Genotipizzazione dei topi mutanti mediante analisi per PCR del loro DNA genomico.
Descrizione: 
Omogeneizzatore di tessuti a velocità regolabile
Campo di applicazione: 
Estrazione di RNA e proteine dai tessuti di topi mutanti per l’analisi fenotipica.
Pubblicazioni: 
  1. Strimpakos G, Corbi N, Pisani C, Di Certo MG, Onori A, Luvisetto S, Severini C, Gabanella F, Monaco L, Mattei E, Passananti C. Novel adeno-associated viral vector delivering the utrophin gene regulator jazz counteracts dystrophic pathology in mdx mice. J Cell Physiol. Sep;229(9): 1283-91. 2014
  2. Andrea Pristerà, Daniele Saraulli, Stefano Farioli-Vecchioli, Georgios Strimpakos, Marco Costanzi, Maria Grazia di Certo, Sara Cannas, Maria Teresa Ciotti, Felice Tirone, Elisabetta Mattei, Vincenzo Cestari and Nadia Canu. Impact of N-tau on adult hippocampal neurogenesis, anxiety and memory Neurobiology of Aging. Nov;34(11):2551-63. 2013.
  3. Laura Micheli, Luca Leonardi1, Filippo Conti1, Giovanna Maresca, Sandra Colazingari, Elisabetta Mattei, S. A.Lira, Stefano Farioli-Vecchioli, Maurizia Caruso, and FeliceTirone. PC4/TIS7/IFRD1 stimulates skeletal musce regeneration and is necessary for myoblast differentiation as a regulator of MyoD and NF-KB. J Biol Chem. Feb 18;286(7):5691-707, 2011.
  4. Gabriele De Luca, Maria Teresa Russo, Paolo Degan, Cecilia Tiveron, Andrea Zijno, Ettore Meccia, Ilenia Ventura, Elisabetta Mattei, Yusaku Nakabeppu, Marco Crescenzi, Rita Pepponi, Antonella Pèzzola, Patrizia Popoli and Margherita Bignami. A role for oxidized DNA precursors in Huntington disease-like striatal neurodegeneration. PLoS Genetics Nov;4(11):e1000266. 2008.
  5. Mattei E, Corbi N, Di Certo MG, Strimpakos G, Severini C, Onori A, Desantis A, Libri V, Buontempo S, Floridi A, Fanciulli M, Baban D, Davies KE, Passananti C. Utrophin up-regulation by an artificial transcription factor in transgenic mice. PLoS ONE. Aug 22;2:e774, 2007.
Referenze: 

Alcuni modelli murini generati dalla nostra Facility in collaborazione con ricercatori CNR e ISS hanno dato origine a brevetti con successivo acquisizione in licensig da parte di industrie farmaceutiche o di società di investimento:

 

  • 2003 Patent Cooperation Treaty (PCT) sul brevetto dal titolo “Non-nucleosidic inhibitors of reverse transcriptase as antagonists of cell proliferation and inducers of cell differentiation” “Patent number: 02793112.0-2123-EP0214727. Ceduto in licensig esclusivo a Fluofarma (Francia). Execution copy of the exclusive agreement del 29.11.2006.

    Questo brevetto riguarda una diversa destinazione d’uso di farmaci inibitori della trascrittasi inversa normalmente usati nella cura dell’AIDS, estendendone l’uso anche alla cura di tumori
     

  • 2005 Brevetto dal titolo “Modello transgenico per il gene sintetico zincfinger, regolatore trascrizionale dell'utrofina” depositato in Italia (Marzo 2005) Patent number: 1359932 - Titolarità CNR 100% Rif.CNR 1672. Ceduto in licensing esclusivo a ILIT Bio-Venture (Israele).

    Questo brevetto riguarda la generazione di un modello murino transgenico per la dimostrazione in vivo dell’efficacia di fattori trascrizionali sintetici che aumentando i livelli di Utrofina endogena, compensano la mancanza della Distrofina che è alla base della Distrofia Muscolare di Duchenne.
     

  • 2013 Brevetto dal titolo: "Vettore adeno-associato ricombinante muscolo-specifico e suo impiego nel trattamento di patologie muscolari." Titolarità CNR 100% Patent application n° TO2013A000669 (5.8.2013) Ceduto in licensing esclusivo a ILIT Bio-Venture (Israele)

    Questo brevetto riguarda la prova di concetto della possibilità di utilizzare i fattori trascrizionali sintetici che aumentano i livelli di Utrofin, veicolati da vettori virali, in applicazioni di terapia genica per la Distrofia Muscolare di Duchenne.